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洛克菲勒大学利用CRISPR《资讯》

发布时间:2020-08-17 13:22:30 阅读: 来源:COC厂家

06-10

2019年5月30日,来自纽约洛克菲勒大学细菌学实验室的LucianoA. Marraffini团队在Nature杂志发表文章——Cas13-induced cellular dormancy prevents the rise of CRISPR-resistant bacteriophage,文章鉴定了Cas13介导的非特异性剪切RNA的能力能够剪切宿主和噬菌体表达的RNA,赋予宿主防御DNA病毒感染和抗CRISPR病毒感染的能力。

细菌的CRISPR(Clustered, regularlyinterspaced, short palindromic repeat)基因座是指被来源于噬菌体和质粒的短片段(spacer)分隔开的30-40bp间隔重复的序列,它和功能与核酸加工相关的CRISPR相关蛋白(CRISPR-associatedprotein, Cas)共同组成细菌的免疫系统。CRISPR基因座可转录出并加工为short CRISPR RNAs (crRNA),介导Cas核酸酶靶向并破坏入侵噬菌体或质粒的互补序列(protospacers),发挥免疫作用。根据效应核酸酶组成的亚基数量,CRISPR-Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成,根据crRNA加工复合体和核酸酶的组分是否存在交互,可进一步再分为Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ型;第二类系统的核酸酶由单一的,多功能的蛋白组成,并根据核酸酶的结构分为Ⅱ,Ⅴ,Ⅵ型。其中,Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,在分子诊断方面具有重要的应用价值(Nature | 快速、准确、经济:CRISPR技术在疾病检测中的崛起)。

Cas13被报道既具有切割与crRNA互补的RNA间隔序列前体(protospacers)能力,还具有一种特殊的性质:它可以非特异性地剪切附带RNA,并且这一过程依赖于Cas13切割间隔序列前体的发生。但这一特性的生理意义目前未知。另一方面,通过分析表达Cas13的原核生物的spacer序列,发现其既靶向RNA病毒,又含有靶向双链DNA病毒的序列,说明Cas13在防御DNA病毒的过程中也起到重要作用,但如何发挥功能并不清楚。而这与Cas13的非特异剪切RNA的能力是否相关一直是研究者们关心的问题。

为研究Cas13的功能,作者首先在type VI-A CRISPR–Cas系统的天然宿主Listeria ivanovii(L.ivanovii)中构建了Cas13介导的Listeriaivanovii ΩCRISPRVI抵御φRR4DNA噬菌体感染的模型。通过构建靶向φRR4全基因组的spacer文库,最终筛选到能够有效防御的三条spacer序列:靶向anti-CRISPR区域的spcA,靶向早期裂解基因的spcE和靶向晚期裂解基因的spcL。表达三条spacer序列能够有效降低病毒的感染中心效率(ECOI,efficiency of centre of infection)和裂解量(burst size)(图1),说明Cas13能够介导宿主抵御DNA噬菌体的感染。

图1:Cas13a阻碍了DNA病毒感染。

鉴于三条spacer序列靶向的序列既包括病毒必需基因,也包括非必需基因,作者认为Cas13的非特异RNA剪切功能发挥了重要作用。因此,作者使用RNA-seq和RNA5’端鉴定的方法分析了噬菌体和宿主的转录产物以鉴定Cas13非特异RNA剪切功能的靶标。结果发现,噬菌体和宿主的转录产物都发生了普遍的断裂(图2)。没有观察到晚期裂解基因的表达可能是由于早期基因mRNA被剪切导致功能丧失进而无法激活晚期基因的表达。以上结果表明,Cas13可以广泛地剪切噬菌体和宿主的转录本mRNA。

图2:Cas13广泛剪切噬菌体(A)和宿主(B)的转录本。

作者发现,Cas13的激活显著抑制宿主的生长(图3A),但并不会导致宿主的死亡。并且,Cas13激活会导致宿主对抗生素的耐受(图3B),进一步证明Cas13激活导致宿主进入休眠状态。同时,将表达spcE的菌株与感染敏感菌株共培养,可以显著保护敏感菌株(图3C),说明Cas13限制噬菌体的增殖进而保护未感染的细胞群体。而使用外源质粒激活CRISPR-Cas13系统,也会保护宿主防御噬菌体的感染(图3D),这表明Cas13激活引起的休眠效应足以发挥对噬菌体感染的抵抗作用。以上实验说明,Cas13激活诱导宿主进入休眠状态,从而防御DNA噬菌体的感染。

图3:Cas13诱导宿主休眠进而抑制噬菌体增殖。

根据Cas13广泛的保护作用,作者猜测即使噬菌体群体中的部分个体发生自然突变,导致crRNA不能与靶向RNA配对(escaper),Cas13也能有效地中和这部分噬菌体。为验证此推测,作者构建不与spcA配对的φRR4acr和不与spcE配对的φRR4early两株突变噬菌体,并将其与野生型噬菌体按照1:105混合后感染细菌,发现Cas13能够有效的清除噬菌体,而单独感染突变噬菌体则不能发挥保护作用(图4)。混合另一株肌尾噬菌体A511也得到了类似的结果。相比Cas13,Cas9不具有类似的保护效应。

图4:Cas13激活抵御非靶标的噬菌体感染。

综上,作者鉴定了Cas13非特异剪切RNA的功能在宿主遭遇DNA病毒和突变破坏crRNA识别的病毒感染时发挥保护作用的机制:激活的Cas13非特异剪切宿主和噬菌体的转录本,减少噬菌体表达和宿主体内的病毒DNA复制必须因子,阻断病毒复制;同时诱导宿主进入休眠状态,进一步阻断噬菌体侵染未被感染的细菌。

关于噬菌体

噬菌体(phage)是侵袭细菌的病毒,也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方,如:泥土、动物的肠道里,都可以找到噬菌体。

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